黑曲霉群菌种多相分类和鉴定方法最新研究进展(2)
【作者】网站采编
【关键词】
【摘要】1.2 细胞外分泌物的特征 作为对外界生物和非生物环境的反应而产生的细胞外泌物的特征,也成为近年来黑曲霉群菌种分类和鉴定过程中常采用的重要依据
1.2 细胞外分泌物的特征
作为对外界生物和非生物环境的反应而产生的细胞外泌物的特征,也成为近年来黑曲霉群菌种分类和鉴定过程中常采用的重要依据[15]。该类物质主要包括次级代谢产物、过量合成的有机酸、积累的碳水化合物(例如海藻糖和多元醇)、胞外酶(extracellular enzymes)、疏水蛋白(hydrophobins)、黏附素(adhesins)、扩张素(expansins)和伴侣蛋白(chaperones)以及某些可能参与避免真菌繁殖结构被昆虫、螨类和其他动物食用的聚酮类和生物碱等[25]。通常分泌到细胞外或聚集在细胞壁上,并随着环境条件的变化而改变。对于那些能够分泌到细胞外的次级代谢产物如真菌毒素和抗菌素等,因具有高度的种属特异性,常被用于黑曲霉群菌种的分类和鉴定[26-27]。此外,黑曲霉群的不同种/株产生的次级代谢产物的差异也得到了全基因组测序研究的支持,即从基因组水平研究可知,黑曲霉群的不同种/株之间次级代谢产物产生能力的差异往往与基因组水平上携带的聚酮与非核糖体肽合成酶基因的数量和相似性密切相关[28-30]。
近年来,随着GC、HPLC、GC-MS、HPLC-MS等技术飞速发展,使得通过检测一种或几种特定的生物标志物而辅助于黑曲霉群菌种的分类和鉴定越来越成为可能。目前,可用于黑曲霉群菌种分类和鉴定且相对易于检测的细胞外泌物主要有neoxaline、黑麦酮酸类(secalonic acid)(包括黑麦酮酸D和F等)、环棒麦角素(cycloclavine)、狐茅麦角碱(festuclavine)、曲地酸(asterric acid)、dihydrogeodin、erdin(土曲霉素)、tensiol A和B、萘并-γ-吡喃酮类化合物(naphtho-γ-pyrones)、赭曲霉毒素(ochratoxins)(包括OTA、OTB、OTα和OTβ)、伏马菌素(fumonisins)(包括FB2、FB4和FB6等)和funalenone等[13]。但考虑到黑曲霉群菌种产生的次级代谢产物具有种属差异并与培养条件密切相关,尤其是培养温度、培养时间、培养基组成等,例如并非所有的黑曲霉群菌种都可以产生OTA,且黑曲霉产生OTA能力和产量与其培养条件密切相关,因此科学合理的实验方案的设计是利用外泌物的特征进行黑曲霉群菌种鉴定的难点[31]。此外,有许多结构尚不清楚但能在黑曲霉群的一个或多个物种中检测到的次级代谢产物,也可以很好的辅助用于黑曲霉群菌种的分类和鉴定。所以,总体来看,细胞外分泌物的特征是未来黑曲霉群菌种分类和鉴定过程中一个很好的补充方法。
1.3 分子生物学鉴定
已有的研究证明,黑曲霉群菌种作为难以分类和鉴定的种群,为了保证鉴定结果的可靠性,除了依靠形态学和细胞外分泌物的特征外,仍需结合限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、PCR-RFLP、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)、序列分析、引物特异性PCR和实时定量荧光PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)等多种分子生物学技术的鉴定结果进行综合判断[32-54],具体情况见表2。
表2 分子生物学技术在黑曲霉群菌种鉴定中的应用情况Table 2 Application of molecular biology technology in identification 分子生物学技术目标基因应用范围文献RFLPpelA、pelB和pki能够区分黑曲霉和塔宾曲霉的鉴定[32]RFLPpelD所有分离株中相对保守,不能用于鉴定。[33]RFLPrDNA能够区分黑曲霉、塔宾曲霉、巴西曲霉、炭黑曲霉、日本曲霉、A. ellipticus和A. aculeatus[2,34]RFLP线粒体DNA能够将黑曲霉和巴西曲霉与塔宾曲霉区分开,日本曲霉与A. aculeatus区分开[34-35]PCR-RFLPITS、IGS、benA能够将黑曲霉群菌种的OTA潜在产毒株与非产毒株[36-39]AFLP能够区分已知的大多数黑曲霉群菌种[40-42]PCR-SSCP能够区分黑曲霉、巴西曲霉和塔宾曲霉在内的11种黑曲霉[43]引物特异性PCRITS能够将黑曲霉区分为4个不同的组[16]引物特异性PCRCytb能够用于推断日本曲霉、、黑曲霉、塔宾曲霉、炭黑曲霉和的系统发育关系[45]引物特异性PCRCoX I和线粒体DNA具有种内和种间变异性,不能用于黑曲霉群菌种的分类和鉴定[46]引物特异性PCRIGS序列变异性太高,不能够用于黑曲霉群菌种的分类和鉴定[13]引物特异性PCR丙酮酸激酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶、翻译起始因子2、转录延伸因子1-α和RNA聚合酶2仅能区分2种至5种黑曲霉[44-53]
RFLP是最早用于黑曲霉群新种鉴定的分子生物学技术。KUSTERS-VAN等[32-33]采用RFLP技术探讨了果胶裂合酶基因(pelA、pelB、pelD)和丙酮酸激酶基因(pki)作为DNA杂交实验的探针用于黑曲霉群菌种快速鉴定的可行性。结果发现,pelD基因在黑曲霉群的所有分离株中具有保守性,不能用于黑曲霉群菌种的鉴定,pelA和pelB可用于黑曲霉和塔宾曲霉的鉴定。KUSTERS-VAN等[32]和VARGA等[34]发现SmaI内切酶消化rDNA后可将黑曲霉、塔宾曲霉、巴西曲霉、炭黑曲霉、日本曲霉、和区分开。VARGA等[34]和HAMARI等[35]发现用HaeIII/BgIII消化线粒体DNA可将黑曲霉和巴西曲霉与塔宾曲霉区分开,日本曲霉与区分开。随后陆续报道了PCR-RFLP用于黑曲霉群菌种鉴定的可行性,尤其是发现采用RsaI消化ITS基因、Hinf I消化IGS基因和RsaI消化β-微管蛋白(beta-tubulin,benA)基因时可将黑曲霉群菌种的OTA潜在产毒株与非产毒株区分开[36-39]。PERRONE等[40-42]发现AFLP技术可以鉴定已知的大多数黑曲霉群菌种。SUSCA等[43]采用PCR-SSCP技术鉴定了包括黑曲霉、巴西曲霉和塔宾曲霉在内的11种黑曲霉。
文章来源:《中国应用生理学杂志》 网址: http://www.zgyyslxzz.cn/qikandaodu/2021/0207/342.html
上一篇:医学诺贝尔之路(1904):循序渐进、谦虚和热情
下一篇:动态视错觉织物创新设计